Röntgen war Sohn des Tuchfabrikanten Friedrich Conrad Röntgen und seiner Ehefrau Charlotte Constantine, geb. Frowein. Er wuchs in Apeldoorn, Niederlande, auf und ging in Utrecht zur Schule.
Da er wegen eines Schülerstreichs das Gymnasium vorzeitig verlassen musste, studierte er ab 1865 an der Eidgenössischen Polytechnischen Schule in Zürich (heute ETH) -an der eine Aufnahmeprüfung ausreichte- Maschinenbau.
1868 erhielt er das Diplom, 1889 promovierte er an der Universität. Hier lernte er den Physiker August Kundt kennen, mit dem er 1870 als Assistent nach Strassburg ging.
An der bayrischen Universität Würzburg konnte er sich wegen des fehlenden Abiturs nicht habilitieren, in Strassburg war man liberaler. 1874 wurde Röntgen Privatdozent, ein Jahr später nahm er eine Professur an der land-und forstwirtschaftlichen Akademie Hohenheim an, doch waren die Arbeitsbedingungen in Strassburg weitaus besser. Schon 1876 kehrte er zu Kundt zurück, als Extraordinarius für theoretische Physik. 1879 wurde er als ordentlicher Professor für Experimentalphysik an der Universität Giessen berufen. Seine wichtigsten Arbeiten hier brachten ihm 1888 den Ruf als Nachfolger von Friedrich Kohlrausch nach Würzburg ein. 1894 war er Rektor der Universität. 1899 auf dem Höhepunkt seines Ruhmes, wurde er nach München berufen. Nach einem Zögern nahm er den Ruf 1900 an. Nach dem Wintersemester 1919/20 trat er vom Lehramt zurück, blieb aber Leiter des „physikalisch-metronomischen Instituts“ des Staates. Unter den Ehrungen, die er nach seiner berühmten Entdeckung der (später nach ihm benannten) „X- Strahlen“ 1895 erhielt, ist der erste Nobelpreis für Physik 1901 besonders hervorzuheben.
Röntgens erste wichtige Untersuchungen 1870-73 befassten sich mit der Bestimmung der spezifischen Wärme von Gasen. Andere Arbeiten befassten sich mit Magnetoptik der Gase und Kristallphysik. Aus der Giessener Zeit ist vor allem die Entdeckung des Magnetfeldes eines im ruhenden Kondensatorfeldes polarisierten und dabei rotierenden Dielektrikums hervorzuheben. In Würzburg wandte sich Röntgen ab 1894 stärker dem Studium der Kathodenstrahlen zu.
Am 8.11.1985 entdeckte er, dass Platincyanür ausserhalb einer Glasröhre fluoreszierte, wenn in dieser durch Hochspannung Kathodenstrahlen erzeugt wurden - obwohl die Röhre durch schwarzes Papier lichtdicht abgeschlossen war. Dieses Datum markiert die Entdeckung der Röntgenstrahlen. Röntgen lehnte jede patentrechtliche Nutzung seiner Entdeckung ab. Durch den öffentliche Wirbel, den sie verursachte, zog er sich für 10 Jahre zurück.